Ngày 19 tháng 8 năm 1561, các phát súng đại bác tại Leith chào mừng Nữ hoàng Mary trở về Scotland. Năm ngày sau, khi nữ hoàng dự lễ Misa tại nhà nguyện hoàng gia tại Holyrood, xảy ra một vụ phản kháng dẫn đến những xô xát. Hôm sau, nữ hoàng ra thông báo yêu cầu giữ nguyên hiện trạng tôn giáo trong nước. Nhiều nhà quý tộc chấp nhận quyết định này của nữ hoàng, nhưng Knox thì không. Đến chủ nhật, Knox đứng trên tòa giảng Nhà thờ St Giles bày tỏ sự phản kháng. Hai tuần sau khi về nước, nữ hoàng cho triệu tập Knox, cáo buộc ông khích động nổi loạn chống mẹ bà và viết sách phản đối thẩm quyền của bà. Knox trả lời rằng ông sẵn lòng phục tùng nữ hoàng như một thần dân miễn là sự cai trị của bà là thích đáng, ông cũng ghi nhận Sứ đồ Phao-lô từng sống dưới thời trị vì của bạo chúa Nero. Và khi Mary hỏi Knox thần dân có quyền đề kháng vương quyền không, Knox trả lời rằng nếu quân vương đi quá giới hạn luật pháp cho phép, người dân có quyền kháng cự, ngay cả bằng bạo lực.[51]